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蛋白質純化系統

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蛋白質純化系統用于蛋白質的分離純化,蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛,是一項重要的操作技術。 一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質,一些含量十分豐富,一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質,必須首先將該蛋白質從其他蛋白質和非蛋白質分子中純化出來。

蛋白質純化系統
蛋白質純化的主要方法及注意事項

蛋白質純化的主要方法及注意事項

蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛,是一項重要的操作技術。 一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質,一些含量十分豐富,一些僅含有幾個拷貝。為了...[查看全部]

蛋白質的分離純化的步驟

通常,對某一特定蛋白質的分離純化的步驟包括前處理、粗分級、細分級三步,下面就讓小編帶你了解一下。


前處理:

對于某種蛋白質的分離純化,首先需要通過溶解的狀態從原來的組織或細胞中釋放出蛋白質并且使原來的天然狀態保持不變,從而使生物活性不丟失生。之后,按照不同的情況,選擇適當的方法,破碎掉組織和細胞。可以使用電動搗碎機或勻漿機破碎或超聲波對動物組織和細胞進行處理破碎。

如果所要的蛋白主要在如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等某一細胞組分集中,那么可以通過差速離心的方法分開它們,對該細胞組分進行收集以作下步純化的材料。如果所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的,那么必須使用超聲波或去污劑解聚膜結構,然后使用適當介質來提取。


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粗分離

當獲得蛋白質提取液(有時還雜有核酸、多糖之類)以后,選擇合適的方法來分離所要的蛋白與其他雜蛋白。通常使用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法來進行這一步的分離。這些方法不但操作簡單,而且能夠處理很多,既可以將大量的雜質除去,又可以使蛋白溶液濃縮。一些蛋白提取液體積比較打,使用沉淀或鹽析法濃縮又不適用,那么進行濃縮的方法可以是超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法。


細分離

樣品在進行粗分級分離以后,通常只有很小的體積,以及去除了絕大多數的雜蛋白大部分。通常使用包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等層析法來進行進一步純化。作為最后的純化步驟選擇包括區帶電泳、等電點聚焦等電泳法也很有必要。蛋白質分離純化的最后步驟結晶,結晶過程不能夠使蛋白一定是均一得到確保,然而只有在溶液中某種蛋白在數量上占有優勢時才能有結晶形成。


離子層析法

當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,會在離子交換劑上吸附帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質,之后通過對pH進行改變等方法洗脫吸附的蛋白質。


有機溶劑提取

與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)可以顯著降低一些蛋白質在水中的溶解度,并且

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蛋白質純化方法-沉淀法

沉淀法

沉淀法又叫做溶解度法。通過各種物質的結構差異性來使溶液的某些性質得到改變,進而改變有效成分的溶解度,為其純化生命大分子物質的基本原理。


1、蛋白質沉淀劑

蛋白質沉淀劑只會對一類或一種蛋白質沉淀起作用,常見的有堿性蛋白質、凝集素和重金屬等。


2、聚乙二醇沉淀作用

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物能夠使得蛋白質發生沉淀作用。


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3、選擇性沉淀法

按照在不同物理化學因子作用下,各種蛋白質穩定性不同的特點,使用適當的選擇性沉淀法,就能夠使雜蛋白變性沉淀,而在溶液中仍然保留欲分離的有效成分,從而使得純化有效成分的目的達到。


4、鹽析法

在稀鹽溶液中,隨著鹽濃度的增高,蛋白質的溶解度也會上升,然而當鹽濃度增高到一定數值時,降低了水活度,從而造成蛋白質分子表面電荷逐漸被中和,逐漸破壞了水化膜,最終導致蛋白質分子間互相凝聚并從溶液中析出。


5、有機溶劑沉淀法

有機溶劑可以使得蛋白質溶解度降低,有如下兩點原因:

(1)和水相比,有機溶劑的介電常數更加的小,從而減小了溶劑的極性。

(2)起到脫水的作用,和鹽溶液相同。


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蛋白質純化的原則

蛋白質純化系統用于蛋白質的分離純化,蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛,是一項重要的操作技術。 一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質,一些含量十分豐富,一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質,必須首先將該蛋白質從其他蛋白質和非蛋白質分子中純化出來。


原則

蛋白純化對不同蛋白間內在的相似性與差異進行利用,對各種蛋白間的相似性進行利用來將非蛋白物質的污染去除并且而利用各蛋白質的差異從其他蛋白中純化出目的蛋白。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性均會存在差異,利用這些差異能夠從如大腸桿菌裂解物等混合物中將蛋白提取出來,從而使重組蛋白得到。


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粗分離和精細純化階段為蛋白的純化主要的兩個階段。通常采用樹脂法來進行蛋白的純化。

粗分離階段主要分開目的蛋白和如DNA、RNA等其他細胞成分,因為,這個時候,樣板具有比較大的體積,比較雜的成分,因而所用的樹脂應當滿足寬粒徑分布,大顆粒,流速高,以及容量高的特點,并且能夠迅速分開蛋白與污染物,如有必要,可以將如蛋白酶抑制劑的相應的保護劑加入,避免降解目的蛋白。

精細純化階段則則需要達到更高的分辨率要求,這個階段需要區分開目的蛋白與那些分子量大小及理化性質接近的蛋白,為了使分辨率提高,需要使用更加小的樹脂顆粒。離子交換柱和疏水柱經常被使用,樹脂的選擇性和柱效兩個因素在應用的時候需要綜合考慮。


蛋白質純化

蛋白質的的物理、化學、生物化學、物理化學和生物學性質取決于它的一級、二級、三級和四級結構,不同蛋白質之間的性質存在差異或者改變條件是使之具有差異,利用一種同時多種性質差異,在兼顧收率和純度的情況下,選擇蛋白質提純的方法。

蛋白質通常通常均是由復雜的混合物形式存在于組織或細胞中,有成千種不同的蛋白質存在于每種類型的細胞內。分離和提純蛋白質非常的艱巨而繁重。直到現在還不能夠從復雜的混合物中使用一個單獨的或一套現成的方法提取出任

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